DHE-RP,超氧化物特異性探針

一、DHE-RP超氧化物熒光探針屬性：
化學(xué)屬性：該探針為有機(jī)熒光小分子，分子結(jié)構(gòu)含可被 O2??特異性攻擊的脫氫位點(diǎn)，同時(shí)帶有核酸結(jié)合基團(tuán)（如插嵌基團(tuán)或靜電結(jié)合基團(tuán)），未激活時(shí)熒光量子產(chǎn)率極低，呈 “熒光淬滅” 狀態(tài)。
特異性?xún)?yōu)勢(shì)：與常規(guī)活性氧探針不同，其識(shí)別位點(diǎn)僅對(duì) O2??的電子轉(zhuǎn)移特性敏感，對(duì)?OH 的強(qiáng)氧化性、1O2的親電加成特性均無(wú)直接響應(yīng)，可有效排除兩種活性氧的檢測(cè)干擾。
熒光性能：未被激活時(shí)無(wú)明顯熒光；經(jīng) O2??脫氫并與核酸結(jié)合后，發(fā)射紅色熒光，激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)通常分別約為518nm和606 nm（具體數(shù)值隨實(shí)驗(yàn)體系（如 pH、溶劑）略有波動(dòng)，建議以實(shí)際測(cè)試為準(zhǔn)）。

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二、反應(yīng)原理：
1. O2?-介導(dǎo)的脫氫反應(yīng)（激活關(guān)鍵）
探針?lè)肿又械幕钚詺涔w基團(tuán)（如酚羥基、氨基取代的烯丙基等）為 O2?-的特異性作用位點(diǎn)。O2?-作為弱氧化劑，通過(guò)電子轉(zhuǎn)移方式奪取該位點(diǎn)的活性氫，使探針?lè)肿影l(fā)生氧化脫氫，生成具有共軛雙鍵的活性中間體。此過(guò)程為不可逆反應(yīng)，且僅能由 O2?-觸發(fā)，?OH、1O2無(wú)法實(shí)現(xiàn)該脫氫機(jī)制。
2.與核酸結(jié)合并產(chǎn)生紅色熒光
脫氫后的活性中間體因共軛體系擴(kuò)展，具備了與核酸（DNA/RNA）結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，主要通過(guò)插嵌作用（嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間）或靜電相互作用（與核酸磷酸骨架結(jié)合）與核酸結(jié)合。結(jié)合后，探針?lè)肿拥姆肿訕?gòu)象趨于穩(wěn)定，熒光量子產(chǎn)率大幅提升，最終在特定激發(fā)光下發(fā)射紅色熒光，熒光強(qiáng)度與體系中 O2?-的濃度呈正相關(guān)（在一定濃度范圍內(nèi)）。

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熒光光譜

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三、通用實(shí)驗(yàn)方法（細(xì)胞外 / 細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)）
以下為該 DHE-RP 常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作流程，可根據(jù)研究場(chǎng)景（如體外體系、細(xì)胞模型）調(diào)整參數(shù)，核心需控制探針濃度、孵育時(shí)間及活性氧干擾。
1.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
試劑配制
探針儲(chǔ)備液：取適量 DHE-RP 粉末，用DMSO溶解，配制成 10~20 mM 的儲(chǔ)備液，分裝后于 - 20℃避光保存，有效期 6 個(gè)月（避免反復(fù)凍融）。
探針工作液：實(shí)驗(yàn)前用緩沖液（如 PBS、HEPES，pH 7.2~7.4）將儲(chǔ)備液稀釋至5~20 μM，現(xiàn)配現(xiàn)用，全程避光。
陽(yáng)性對(duì)照：超氧陰離子發(fā)生劑（如黃嘌呤 - 黃嘌呤氧化酶體系，X/XOD）；陰性對(duì)照：超氧陰離子清除劑（如超氧化物歧化酶，SOD，200~500 U/mL）。
實(shí)驗(yàn)材料：緩沖液（PBS/HEPES）、熒光酶標(biāo)儀 / 激光共聚焦顯微鏡、離心管 / 96 孔板 / 細(xì)胞培養(yǎng)皿、移液槍?zhuān)ū芄馕^）。
方法 1：細(xì)胞外體系 O???檢測(cè)（96 孔板法，熒光酶標(biāo)儀）
適用于體外溶液中 O???的定量檢測(cè)，如酶促反應(yīng)體系、藥物誘導(dǎo)的自由基生成體系。
向 96 孔黑色避光板中加入反應(yīng)緩沖液（如 PBS），每孔 80 μL。
加入探針工作液，每孔 10 μL，輕輕吹打混勻，室溫避光孵育 5 min。
加入待檢測(cè)樣品（或陽(yáng)性 / 陰性對(duì)照），每孔 10 μL，使體系終體積為 100 μL，探針終濃度為 0.5~2 μM。
室溫避光孵育15~30 min，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光信號(hào)：激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為 518~570 nm，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)為 580~620 nm，記錄每孔的相對(duì)熒光強(qiáng)度（RFU）。
數(shù)據(jù)處理：以陰性對(duì)照孔的熒光強(qiáng)度為基線(xiàn)，計(jì)算樣品孔的相對(duì)熒光值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（若需定量）確定 O???濃度。
方法 2：細(xì)胞內(nèi) O???檢測(cè)（激光共聚焦顯微鏡法）
適用于活細(xì)胞內(nèi) O???的定位與定性檢測(cè)，需保證細(xì)胞活性，全程避光操作。
細(xì)胞培養(yǎng)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，密度為 5×10?~1×10?個(gè) / 皿，置于 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，使細(xì)胞貼壁。
探針?lè)跤何囵B(yǎng)基，用預(yù)溫的 PBS 輕輕洗滌細(xì)胞 2 次，加入含5~10 μM探針工作液的無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中避光孵育20~40 min。
洗滌：吸除探針培養(yǎng)基，用預(yù)溫的 PBS 洗滌細(xì)胞 3 次，每次 5 min，洗去未進(jìn)入細(xì)胞的游離探針。
加樣處理：加入含待檢測(cè)刺激物（或陽(yáng)性 / 陰性對(duì)照）的無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育指定時(shí)間（如 10~60 min，根據(jù)刺激物起效時(shí)間調(diào)整）。
熒光成像：將培養(yǎng)皿置于激光共聚焦顯微鏡下，選擇合適的激發(fā)光（518~570 nm），采集發(fā)射光（580~620 nm）的熒光圖像，觀察細(xì)胞內(nèi)紅色熒光的分布與強(qiáng)度。
對(duì)照設(shè)置：
空白對(duì)照：僅加細(xì)胞和無(wú)血清培養(yǎng)基，不加探針；
陰性對(duì)照：細(xì)胞孵育探針后，加入 SOD（終濃度 200 U/mL）再加入刺激物；
陽(yáng)性對(duì)照：細(xì)胞孵育探針后，加入 X/XOD 體系（黃嘌呤終濃度 0.1 mM，黃嘌呤氧化酶終濃度 0.01 U/mL）。

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