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Calcein-AM/PI活死細胞雙染試劑盒

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names：
Calcein-AM/PI Double Staining Kit
CAS號：

MDL Number：
MF(分子式)： Calcein-AM/PI MW(分子量)： N/A
EINECS: Reaxys Number:
Pubchem ID: Brand:BIOFOUNT

Calcein-AM/PI細胞雙染試劑盒內含兩種染料：Calcein-AM和Propidium Iodide (PI)。該試劑盒可以在熒光顯微鏡下同時觀察在同一個細胞培養皿中的活細胞和死細胞。Calcein-AM可透過細胞膜，通過活細胞內的酯酶作用脫去AM基團，產生的Calcein (鈣黃綠素) 發出強綠色熒光，因此活細胞在熒光顯微鏡下可被檢測到綠色熒光。PI可以通過受損的細胞膜進入到死細胞內并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產生紅色熒光，因此死細胞會被檢測到紅色熒光。除了用熒光顯微鏡外，也有報道可以用流式細胞儀和熒光酶標儀來進行定量檢測。

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中文別名	活死細胞雙染試劑盒
英文別名	Calcein-AM/PI Double Staining Kit
CAS號
Inchi	NA
InchiKey	NA
分子式 Formula	Calcein-AM/PI
分子量 Molecular Weight	N/A
溶解度Solubility
性狀	溶液形式
儲藏條件 Storage conditions	-4℃低溫避光保存

Calcein-AM/PI細胞雙染試劑盒 熒光特性：
Calcein-AM : λex=490 nm , λem=515 nm
PI : λex=530 nm , λem=580 nm

Calcein-AM/PI細胞雙染試劑盒染色案例：

細胞染色實例

（a）（b）（c）

1. Calcein-AM染FTC細胞（活細胞單染）
2. PI染HCT116細胞（死細胞單染）
3. Calcein-AM、PI染MHD-1 細胞（活死細胞雙染）

Calcein-AM/PI 最適濃度:
由于不同細胞種類、細胞濃度的染色條件不同，我們建議自行摸索一下Calcein-AM和PI的最適濃度。
Calcein-AM和PI的最佳濃度是根據不同的細胞種類而定，通過以下的操作，我們可以找到不同細胞染色試劑的最佳濃度：
1. 通過在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黃皂苷中培養10 min或通過在70%乙醇中培養30 min制備死細胞。
2. 用0.1-10 μM PI溶液染死細胞，以便找到僅針對細胞核染色而不對細胞質染色的PI濃度。
3. 用0.1-10 μM Calcein-AM溶液染死細胞，以便找到不對細胞質染色的Calcein-AM濃度，再以此濃度的Calcein-AM對活細胞染色以檢驗活細胞是否被染色。

Calcein-AM/PI細胞雙染試劑盒實驗步驟
以HeLa細胞為例
制備1 mmol/l的Calcein-AM儲存液
【500 次】
將200 μl DMSO加入到含200 μg Calcein-AM粉末的管中，用移液器吹打溶解。
【3000 次】
將1 ml DMSO加入到含1 mg Calcein-AM粉末的管中，用移液器吹打溶解。
※Calcein-AM儲存液需要避光，在-20℃密封保存。

使用方法
1. 工作液的配制
1.1 1×Assay Buffer（反應緩沖液）的配制
從低溫冰箱內取出10×Assay Buffer，根據單次用量無菌條件取出適量，用去離子水（dH2O）做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer。
注意：低溫情況可能有析出現象，可在室溫情況下搖勻使用。

1.2 1×染色工作液的配制
1）先將低溫保存的Calcein-AM溶液 (2 mM)和PI溶液（1.5 mM）回到室溫20-30 min。
注意：第一次使用可對母液進行分裝，以減少反復凍融次數。

2）取5 µL Calcein-AM溶液 (2 mM)和15µL PI溶液（1.5 mM）加入5 mL 1×Assay Buffer，充分混勻。此時得到Calcein-AM的工作液濃度為2 μM，PI的工作液濃度為4.5 μM。由于不同細胞系的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定 Calcein-AM和PI的最適濃度。梯度篩選的原則為使用最低的探針濃度得到最好的熒光結果。

注意：由于Calcein-AM的穩定性比較差，此染色工作液必須現配現用，并且在當天用完。

2. 染色步驟
2.1 對于貼壁細胞，先用細胞刮刀或者胰酶-EDTA消化細胞，之后離心收集細胞（1000 rpm，3 min）。
對于懸浮細胞，直接離心（1000 rpm，3 min）收集細胞。
2.2 去上清，用1×Assay Buffer充分清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。
2.3 用1×Assay Buffer制備細胞懸液，使其密度為1×105~1×106細胞/mL。
2.4 取100 µL染色工作液加入200 µL細胞懸液內，混勻，37℃孵育15 min。
注意：如果需要，可延長孵育時間至30min。
2.5 熒光顯微鏡下使用490±10 nm激發濾片同時檢測活細胞（黃綠色熒光）以及死細胞（紅色熒光）。另外，使用545 nm的發射濾片僅能觀察到死細胞。也可以直接在熒光酶標儀下使用合適的濾片進行檢測。
注意：可以使用以下方法來優化得到兩種熒光染料的最佳工作濃度。
a）用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育細胞10 min，或者用70%乙醇孵育細胞30 min，從而制備死細胞；
b）用0.1-10 µM的PI溶液進行死細胞染色，以得到僅僅對細胞核染色，而不會對細胞質染色的最佳工作濃度。
c）用0.1-10 µM的Calcein-AM進行死細胞染色，以得到不會對細胞質染色的最佳工作濃度。然后用此濃度進行活細胞染色，去觀察是否活細胞能被染色。

實驗注意事項
1. 由于本試劑盒中的Calcein-AM Reagent 粉末和PI Stock Solution量很少，有可能會粘在蓋子或管壁上，開封前請先渦旋以使其振落下來。
2. 由于Calcein-AM儲存液對潮氣敏感，請在使用后密閉Calcein-AM儲存液的蓋子。如果不能一次用完，建議分裝保存，例如分裝成10 μl/管，用封口膜封口，并用鋁箔紙包裹，放在一個密閉性能好的塑料袋中，并放入一包干燥劑，在≤-20℃密封避光保存。
3. 配制好的染色工作液請在當天使用。
4. PI有疑似致癌性，使用前應注意以下幾點：
a.使用時請帶好手套，口罩，防護眼鏡等，不要接觸到或呼吸到。
b.當PI不慎接觸到皮膚時，請立刻用大量的水沖洗。
c.處理方法
清洗容器的清洗液和廢液請按照實驗室的有毒有害物質的處理方法進行處理，或按照以下方法處理：
用UV照射的方法進行分解
用次氯酸鈉氧化分解后，進行中和處理

產品說明	Calcein-AM/PI細胞雙染試劑盒內含兩種染料：Calcein-AM和Propidium Iodide (PI)。該試劑盒可以在熒光顯微鏡下同時觀察在同一個細胞培養皿中的活細胞和死細胞。Calcein-AM可透過細胞膜，通過活細胞內的酯酶作用脫去AM基團，產生的Calcein (鈣黃綠素) 發出強綠色熒光，因此活細胞在熒光顯微鏡下可被檢測到綠色熒光。
Introduction
Application1
Application2
Application3