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DNA和RNA純化方法
Release Time：2022-09-20DNA和RNA純化方法:您是否正在建立一個(gè)新實(shí)驗(yàn)室并想知道您需要什么來(lái)純化 DNA 和 RNA？ 或者您是否發(fā)現(xiàn)您的樣品對(duì)于您的下游應(yīng)用來(lái)說(shuō)不夠純凈？
與核酸提取相比，DNA 和 RNA 純化不包括任何破壞細(xì)胞膜和釋放核酸的裂解步驟。 相反，它涉及您的樣品的清理，例如 有效去除所有在 PCR 過(guò)程中用于促進(jìn)目標(biāo)序列擴(kuò)增的成分。
1. 乙醇和異丙醇沉淀
我們將仔細(xì)研究的第一種純化方法是乙醇和異丙醇沉淀。這是純化基因組 DNA 的首選方法，可用于在 CsCl 密度梯度離心與 EthBr、苯酚-氯仿提取、消化和 PCR 等應(yīng)用后濃縮和脫鹽核酸樣品。
1.1 它的工作原理？
乙醇和異丙醇沉淀都與溶解度有關(guān)。水和核酸都是極性分子，這就是DNA和RNA容易溶于水的原因。要沉淀它們，您可以使用乙醇或異丙醇。
對(duì)于乙醇沉淀，您需要向溶液中加入兩倍體積的冰冷的 96% 乙醇和鹽（通常是乙酸鈉）。乙醇降低介電常數(shù)，使糖磷酸骨架上的負(fù)電荷被乙酸鈉的 Na+ 離子中和。由于核酸現(xiàn)在的親水性降低，當(dāng)您在冰上孵育混合物時(shí)，它們會(huì)從溶液中脫落。然后離心您的樣品以將核酸與其他核酸分離，并在冷的 70% 乙醇中清洗沉淀以去除任何殘留的鹽分。再次離心樣品，去除乙醇，讓核酸沉淀干燥，然后將其重新懸浮在干凈的水性緩沖液中。
要干燥核酸沉淀，您可以將試管（打開(kāi)蓋子）放在層流罩幾個(gè)小時(shí)，或使用真空離心機(jī)。您選擇的方法取決于您，但您必須確保顆粒完全干燥，以避免殘留的乙醇對(duì)您的下游應(yīng)用產(chǎn)生負(fù)面影響。
異丙醇沉淀非常相似。唯一的區(qū)別是您可以跳過(guò)冰上孵育步驟，并在第一步中用室溫異丙醇代替冰冷的乙醇。關(guān)于異丙醇的體積，等于樣品體積的量就足夠了。
乙醇還是異丙醇更合適取決于您的樣品體積、濃度和核酸片段的大小。如果您有大量樣品，可能無(wú)法將兩倍樣品體積的乙醇加入試管中。異丙醇沉淀對(duì)于較大核酸片段和較低樣品濃度的沉淀也是優(yōu)選的，因?yàn)楹怂嵩诋惐贾械娜芙舛容^低。最重要的是，異丙醇沉淀是更快的方法，因?yàn)槟恍枰陔x心前孵育您的樣品。
1.2 優(yōu)缺點(diǎn)
乙醇和異丙醇沉淀根本不昂貴，因?yàn)橐掖?、異丙醇和乙酸鈉非常便宜，并且該過(guò)程提供了高純度核酸的良好收率。然而，這是一個(gè)非常耗時(shí)的過(guò)程，并且由于需要手動(dòng)執(zhí)行，因此變化很大。因此，低再現(xiàn)性可能是一個(gè)問(wèn)題。
1.3 所需設(shè)備
乙醇或異丙醇沉淀所需的只是離心機(jī)和層流罩，或真空離心機(jī)來(lái)干燥顆粒。
2. 凝膠電泳和離心柱純化
由于凝膠電泳根據(jù)核酸長(zhǎng)度分離核酸，因此您可以使用此方法將感興趣的核酸與其他核酸類(lèi)型和污染物分離。
2.1 它是如何工作的？
首先，您需要運(yùn)行凝膠。有關(guān)如何進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的更多詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱我們關(guān)于核酸定量和可視化的文章的第 1 節(jié)。
可視化凝膠后，使用鋒利的手術(shù)刀切除感興趣的核酸條帶。 在此步驟中，請(qǐng)始終記住佩戴適當(dāng)?shù)?PPE（面罩和手套），尤其是在使用紫外線(xiàn)來(lái)顯示您的樂(lè)隊(duì)時(shí)。 然后，使用合適的離心柱純化試劑盒從 TAE 或 TBE 緩沖瓊脂糖凝膠中純化核酸條帶。 由于可用的各種套件彼此略有不同，因此您應(yīng)仔細(xì)遵循制造商的說(shuō)明。 通常，您需要稱(chēng)量核酸條帶的重量，每 100 mg 凝膠切片添加指定量的緩沖液，然后加熱混合物以溶解瓊脂糖。然后將樣品轉(zhuǎn)移到離心柱并純化核酸 酸使用結(jié)合、洗滌和洗脫步驟。 有關(guān)離心柱協(xié)議如何工作的更多詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱我們關(guān)于核酸提取的文章的第 2.2.2.1 節(jié)。
2.2 優(yōu)缺點(diǎn)
這種核酸純化方法的巨大優(yōu)勢(shì)在于瓊脂糖不會(huì)使核酸變性，因此很容易從凝膠中回收它們而不會(huì)造成任何傷害。但是，它不適合高通量實(shí)驗(yàn)室，因?yàn)檫\(yùn)行凝膠非常耗時(shí)，并且僅限于少量樣品。
2.3 所需設(shè)備
與其他純化方法相比，此工作流程需要許多不同的儀器。瓊脂糖凝膠電泳需要凝膠電泳系統(tǒng)、外部電源和生物安全柜，因?yàn)槟鷮⑹褂梦ｋU(xiǎn)的嵌入染料。離心柱純化要求不高，因?yàn)槟恍枰慌_(tái)離心機(jī)。
3. 離心柱純化
離心柱不僅用于從裂解樣品中提取核酸，還用于純化它們，例如在 PCR 反應(yīng)后去除可能抑制后續(xù)應(yīng)用的鹽、酶、引物、引物二聚體和核苷酸。
3.1 它是如何工作的？
如上所述，離心柱純化方案包括結(jié)合、洗滌和洗脫步驟。將樣品轉(zhuǎn)移到離心柱中后，將它們離心以將核酸結(jié)合到柱內(nèi)的膜上。這允許不需要的組件通過(guò)。使用洗滌緩沖液的幾個(gè)額外的離心步驟去除殘留的不需要的材料，使用洗脫緩沖液的最后離心步驟將核酸從膜中釋放出來(lái)。
3.2 優(yōu)缺點(diǎn)
如您所見(jiàn)，這種純化方法既快速又簡(jiǎn)單。最重要的是，它可以適應(yīng)您的樣品數(shù)量，因?yàn)槟部梢允褂?96 孔硅膠膜板代替單離心柱。但是，膜可能會(huì)堵塞，并且由于需要 30-50 μl 的最小洗脫體積，因此您可能會(huì)得到相當(dāng)?shù)偷暮怂釢舛取?br /> 3.3 所需設(shè)備
離心柱純化所需的唯一設(shè)備是離心機(jī)，除非您使用 96 孔格式并更喜歡使用帶泵的真空歧管，這也是可能的。
4. 磁珠純化
就像離心柱一樣，磁珠既可用于從裂解樣品中提取核酸，也可用于純化。例如，您可以使用磁珠從 PCR 產(chǎn)物中去除鹽、酶、引物、引物二聚體和核苷酸，否則會(huì)抑制后續(xù)應(yīng)用。
4.1 它是如何工作的？
使用磁珠的純化工作流程與提取工作流程非常相似。您首先添加將核酸結(jié)合到樣品上的磁珠。
然后將試管放在磁鐵上，去除含有不需要的未結(jié)合物質(zhì)的上清液。您重復(fù)此步驟幾次，在其間更換洗滌緩沖液。最后，您添加洗脫緩沖液并將樣品轉(zhuǎn)移到不同的容器中。
與使用磁珠的提取方案相比，在純化過(guò)程中只有特定長(zhǎng)度的核酸片段與磁珠結(jié)合。這種尺寸排阻機(jī)制是通過(guò)為感興趣的核酸片段創(chuàng)造完美的結(jié)合條件，通過(guò)改變緩沖液、鹽和它們的濃度以及因此的親水性/疏水性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
4.2 優(yōu)缺點(diǎn)
磁珠純化的一個(gè)巨大優(yōu)勢(shì)是可以根據(jù)您的預(yù)算選擇所需的設(shè)備。
選項(xiàng) 1：獲取磁性支架并手動(dòng)執(zhí)行工作流程。這是最便宜的選擇，但也是最乏味和最容易出錯(cuò)的方法。您需要非常小心不要吸入珠子，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致樣品損失。
選項(xiàng) 2：對(duì)于高通量應(yīng)用，您還可以購(gòu)買(mǎi)臺(tái)式移液機(jī)器人，或 96 或 384 通道移液器。這些設(shè)備減少了手動(dòng)液體處理步驟，提高了生產(chǎn)率和可重復(fù)性，也可用于其他應(yīng)用。有關(guān)如何將此類(lèi)設(shè)備用于磁珠純化的更多信息，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)我們關(guān)于使用 MACHEREY-NAGEL 的 NucleoSpin® 96 質(zhì)粒試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒 DNA 純化、使用 Beckman Coulter AMPure XP 磁珠和 ASSIST PLUS 進(jìn)行 PCR 純化以及使用Beckman Coulter AMPure XP 磁珠和 VIAFLO 96。
選項(xiàng) 3：通過(guò)購(gòu)買(mǎi)專(zhuān)用純化系統(tǒng)自動(dòng)化整個(gè)工作流程。
磁珠純化的另一個(gè)方便之處在于，您可以使用比旋轉(zhuǎn)柱純化更低的洗脫體積，而且它更易于擴(kuò)展，因?yàn)槟梢詫⑺c 384 孔板一起使用。
4.3 所需設(shè)備
如前所述，您可以將磁珠純化設(shè)備與您的預(yù)算相匹配。如果預(yù)算有限，可以購(gòu)買(mǎi)磁性支架，如果有更多資金，可以購(gòu)買(mǎi)臺(tái)式移液機(jī)器人或 96 或 384 通道移液器，或者使用專(zhuān)用的純化系統(tǒng)。
5.Sephadex® 純化
Sephadex 純化可用于從較小的分子中純化核酸，例如引物、核苷酸或染料。
5.1 它是如何工作的？
Sephadex 是一種凝膠過(guò)濾樹(shù)脂，由環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)的葡聚糖制成。5 要制備樹(shù)脂，您需要將 Sephadex 粉末添加到離心柱中，用水再水合，然后離心柱以去除多余的水。在第二次旋轉(zhuǎn)色譜柱之前，將樣品添加到樹(shù)脂頂部。在離心過(guò)程中，較大的分子很容易通過(guò)樹(shù)脂并洗脫，而較小的分子會(huì)被困在葡聚糖珠的孔隙中。微珠的尺寸排除能力取決于您選擇的 Sephadex 類(lèi)型。例如，Sephadex G-25 Medium5可用于純化分子量>5000的核酸，G-50 Medium6適用于分子量>30000的分子。
為了加快這一工作流程，請(qǐng)選擇預(yù)裝 Sephadex 的離心柱，而不是自己創(chuàng)建它們，或者在 96 孔過(guò)濾板中工作。
5.2 優(yōu)缺點(diǎn)
就像離心柱純化一樣，該方法可以根據(jù)您的通量需求進(jìn)行調(diào)整，方法是在離心柱或 96 孔濾板中進(jìn)行。不存在分子-基質(zhì)結(jié)合步驟還可以防止對(duì)核酸造成不必要的損傷，7 使其成為一種相當(dāng)溫和的純化方法。然而，這非常耗時(shí)，尤其是在您自己準(zhǔn)備離心柱或過(guò)濾板時(shí)——Sephadex 必須再水合大約三個(gè)小時(shí)——而且不能自動(dòng)化。
5.3 所需設(shè)備
Sephadex 純化所需的唯一設(shè)備是離心機(jī)。
6. 酶促方法
如果您的后續(xù)應(yīng)用，一些制造商會(huì)提供酶法來(lái)清理您的 PCR 產(chǎn)物——例如Sanger 測(cè)序、下一代測(cè)序或 SNP 分析——要求您的樣品不含未摻入的引物和 dNTP。
6.1 它是如何工作的？
酶促方法僅包括兩個(gè)步驟。首先，將酶混合物添加到樣品中，并在 37 °C 下孵育 15 分鐘。在孵育過(guò)程中，混合物中的第一種酶，核酸外切酶 I，將消化多余的引物，第二種酶，堿性磷酸酶，將去磷酸化 PCR 期間未消耗的 dNTP。酶發(fā)揮作用后，您可以將樣品加熱到 80 °C 再加熱 15 分鐘以使酶失活。
6.2 優(yōu)缺點(diǎn)
除了快速簡(jiǎn)便之外，此方法不會(huì)導(dǎo)致樣品損失，并且可以輕松適應(yīng)您的樣品數(shù)量。它唯一的缺點(diǎn)是它只能用于從引物和 dNTPs 中清除 PCR 產(chǎn)物，而不能去除任何其他 cont
7. 結(jié)論
如您所見(jiàn)，每種樣品類(lèi)型、下游應(yīng)用和預(yù)算都有一種核酸純化方法。 我們希望本文能幫助您確定選擇哪一個(gè)來(lái)滿(mǎn)足您的特定需求。
如果您來(lái)這里不僅是為了了解核酸純化的技巧，您可能還想了解收集樣本、提取核酸、執(zhí)行 PCR 反應(yīng)和量化核酸所需的知識(shí)。 當(dāng)我們正在裝備一個(gè)新的內(nèi)部實(shí)驗(yàn)室時(shí)，我們整理了這個(gè)由五部分組成的系列，現(xiàn)在看起來(lái)像這樣：
與核酸提取相比，DNA 和 RNA 純化不包括任何破壞細(xì)胞膜和釋放核酸的裂解步驟。 相反，它涉及您的樣品的清理，例如 有效去除所有在 PCR 過(guò)程中用于促進(jìn)目標(biāo)序列擴(kuò)增的成分。
1. 乙醇和異丙醇沉淀
我們將仔細(xì)研究的第一種純化方法是乙醇和異丙醇沉淀。這是純化基因組 DNA 的首選方法，可用于在 CsCl 密度梯度離心與 EthBr、苯酚-氯仿提取、消化和 PCR 等應(yīng)用后濃縮和脫鹽核酸樣品。
1.1 它的工作原理？
乙醇和異丙醇沉淀都與溶解度有關(guān)。水和核酸都是極性分子，這就是DNA和RNA容易溶于水的原因。要沉淀它們，您可以使用乙醇或異丙醇。
對(duì)于乙醇沉淀，您需要向溶液中加入兩倍體積的冰冷的 96% 乙醇和鹽（通常是乙酸鈉）。乙醇降低介電常數(shù)，使糖磷酸骨架上的負(fù)電荷被乙酸鈉的 Na+ 離子中和。由于核酸現(xiàn)在的親水性降低，當(dāng)您在冰上孵育混合物時(shí)，它們會(huì)從溶液中脫落。然后離心您的樣品以將核酸與其他核酸分離，并在冷的 70% 乙醇中清洗沉淀以去除任何殘留的鹽分。再次離心樣品，去除乙醇，讓核酸沉淀干燥，然后將其重新懸浮在干凈的水性緩沖液中。
要干燥核酸沉淀，您可以將試管（打開(kāi)蓋子）放在層流罩幾個(gè)小時(shí)，或使用真空離心機(jī)。您選擇的方法取決于您，但您必須確保顆粒完全干燥，以避免殘留的乙醇對(duì)您的下游應(yīng)用產(chǎn)生負(fù)面影響。
異丙醇沉淀非常相似。唯一的區(qū)別是您可以跳過(guò)冰上孵育步驟，并在第一步中用室溫異丙醇代替冰冷的乙醇。關(guān)于異丙醇的體積，等于樣品體積的量就足夠了。
乙醇還是異丙醇更合適取決于您的樣品體積、濃度和核酸片段的大小。如果您有大量樣品，可能無(wú)法將兩倍樣品體積的乙醇加入試管中。異丙醇沉淀對(duì)于較大核酸片段和較低樣品濃度的沉淀也是優(yōu)選的，因?yàn)楹怂嵩诋惐贾械娜芙舛容^低。最重要的是，異丙醇沉淀是更快的方法，因?yàn)槟恍枰陔x心前孵育您的樣品。
1.2 優(yōu)缺點(diǎn)
乙醇和異丙醇沉淀根本不昂貴，因?yàn)橐掖?、異丙醇和乙酸鈉非常便宜，并且該過(guò)程提供了高純度核酸的良好收率。然而，這是一個(gè)非常耗時(shí)的過(guò)程，并且由于需要手動(dòng)執(zhí)行，因此變化很大。因此，低再現(xiàn)性可能是一個(gè)問(wèn)題。
1.3 所需設(shè)備
乙醇或異丙醇沉淀所需的只是離心機(jī)和層流罩，或真空離心機(jī)來(lái)干燥顆粒。
2. 凝膠電泳和離心柱純化
由于凝膠電泳根據(jù)核酸長(zhǎng)度分離核酸，因此您可以使用此方法將感興趣的核酸與其他核酸類(lèi)型和污染物分離。
2.1 它是如何工作的？
首先，您需要運(yùn)行凝膠。有關(guān)如何進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的更多詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱我們關(guān)于核酸定量和可視化的文章的第 1 節(jié)。
可視化凝膠后，使用鋒利的手術(shù)刀切除感興趣的核酸條帶。 在此步驟中，請(qǐng)始終記住佩戴適當(dāng)?shù)?PPE（面罩和手套），尤其是在使用紫外線(xiàn)來(lái)顯示您的樂(lè)隊(duì)時(shí)。 然后，使用合適的離心柱純化試劑盒從 TAE 或 TBE 緩沖瓊脂糖凝膠中純化核酸條帶。 由于可用的各種套件彼此略有不同，因此您應(yīng)仔細(xì)遵循制造商的說(shuō)明。 通常，您需要稱(chēng)量核酸條帶的重量，每 100 mg 凝膠切片添加指定量的緩沖液，然后加熱混合物以溶解瓊脂糖。然后將樣品轉(zhuǎn)移到離心柱并純化核酸 酸使用結(jié)合、洗滌和洗脫步驟。 有關(guān)離心柱協(xié)議如何工作的更多詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱我們關(guān)于核酸提取的文章的第 2.2.2.1 節(jié)。
2.2 優(yōu)缺點(diǎn)
這種核酸純化方法的巨大優(yōu)勢(shì)在于瓊脂糖不會(huì)使核酸變性，因此很容易從凝膠中回收它們而不會(huì)造成任何傷害。但是，它不適合高通量實(shí)驗(yàn)室，因?yàn)檫\(yùn)行凝膠非常耗時(shí)，并且僅限于少量樣品。
2.3 所需設(shè)備
與其他純化方法相比，此工作流程需要許多不同的儀器。瓊脂糖凝膠電泳需要凝膠電泳系統(tǒng)、外部電源和生物安全柜，因?yàn)槟鷮⑹褂梦ｋU(xiǎn)的嵌入染料。離心柱純化要求不高，因?yàn)槟恍枰慌_(tái)離心機(jī)。
3. 離心柱純化
離心柱不僅用于從裂解樣品中提取核酸，還用于純化它們，例如在 PCR 反應(yīng)后去除可能抑制后續(xù)應(yīng)用的鹽、酶、引物、引物二聚體和核苷酸。
3.1 它是如何工作的？
如上所述，離心柱純化方案包括結(jié)合、洗滌和洗脫步驟。將樣品轉(zhuǎn)移到離心柱中后，將它們離心以將核酸結(jié)合到柱內(nèi)的膜上。這允許不需要的組件通過(guò)。使用洗滌緩沖液的幾個(gè)額外的離心步驟去除殘留的不需要的材料，使用洗脫緩沖液的最后離心步驟將核酸從膜中釋放出來(lái)。
3.2 優(yōu)缺點(diǎn)
如您所見(jiàn)，這種純化方法既快速又簡(jiǎn)單。最重要的是，它可以適應(yīng)您的樣品數(shù)量，因?yàn)槟部梢允褂?96 孔硅膠膜板代替單離心柱。但是，膜可能會(huì)堵塞，并且由于需要 30-50 μl 的最小洗脫體積，因此您可能會(huì)得到相當(dāng)?shù)偷暮怂釢舛取?br /> 3.3 所需設(shè)備
離心柱純化所需的唯一設(shè)備是離心機(jī)，除非您使用 96 孔格式并更喜歡使用帶泵的真空歧管，這也是可能的。
4. 磁珠純化
就像離心柱一樣，磁珠既可用于從裂解樣品中提取核酸，也可用于純化。例如，您可以使用磁珠從 PCR 產(chǎn)物中去除鹽、酶、引物、引物二聚體和核苷酸，否則會(huì)抑制后續(xù)應(yīng)用。
4.1 它是如何工作的？
使用磁珠的純化工作流程與提取工作流程非常相似。您首先添加將核酸結(jié)合到樣品上的磁珠。
然后將試管放在磁鐵上，去除含有不需要的未結(jié)合物質(zhì)的上清液。您重復(fù)此步驟幾次，在其間更換洗滌緩沖液。最后，您添加洗脫緩沖液并將樣品轉(zhuǎn)移到不同的容器中。
與使用磁珠的提取方案相比，在純化過(guò)程中只有特定長(zhǎng)度的核酸片段與磁珠結(jié)合。這種尺寸排阻機(jī)制是通過(guò)為感興趣的核酸片段創(chuàng)造完美的結(jié)合條件，通過(guò)改變緩沖液、鹽和它們的濃度以及因此的親水性/疏水性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
4.2 優(yōu)缺點(diǎn)
磁珠純化的一個(gè)巨大優(yōu)勢(shì)是可以根據(jù)您的預(yù)算選擇所需的設(shè)備。
選項(xiàng) 1：獲取磁性支架并手動(dòng)執(zhí)行工作流程。這是最便宜的選擇，但也是最乏味和最容易出錯(cuò)的方法。您需要非常小心不要吸入珠子，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致樣品損失。
選項(xiàng) 2：對(duì)于高通量應(yīng)用，您還可以購(gòu)買(mǎi)臺(tái)式移液機(jī)器人，或 96 或 384 通道移液器。這些設(shè)備減少了手動(dòng)液體處理步驟，提高了生產(chǎn)率和可重復(fù)性，也可用于其他應(yīng)用。有關(guān)如何將此類(lèi)設(shè)備用于磁珠純化的更多信息，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)我們關(guān)于使用 MACHEREY-NAGEL 的 NucleoSpin® 96 質(zhì)粒試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒 DNA 純化、使用 Beckman Coulter AMPure XP 磁珠和 ASSIST PLUS 進(jìn)行 PCR 純化以及使用Beckman Coulter AMPure XP 磁珠和 VIAFLO 96。
選項(xiàng) 3：通過(guò)購(gòu)買(mǎi)專(zhuān)用純化系統(tǒng)自動(dòng)化整個(gè)工作流程。
磁珠純化的另一個(gè)方便之處在于，您可以使用比旋轉(zhuǎn)柱純化更低的洗脫體積，而且它更易于擴(kuò)展，因?yàn)槟梢詫⑺c 384 孔板一起使用。
4.3 所需設(shè)備
如前所述，您可以將磁珠純化設(shè)備與您的預(yù)算相匹配。如果預(yù)算有限，可以購(gòu)買(mǎi)磁性支架，如果有更多資金，可以購(gòu)買(mǎi)臺(tái)式移液機(jī)器人或 96 或 384 通道移液器，或者使用專(zhuān)用的純化系統(tǒng)。
5.Sephadex® 純化
Sephadex 純化可用于從較小的分子中純化核酸，例如引物、核苷酸或染料。
5.1 它是如何工作的？
Sephadex 是一種凝膠過(guò)濾樹(shù)脂，由環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)的葡聚糖制成。5 要制備樹(shù)脂，您需要將 Sephadex 粉末添加到離心柱中，用水再水合，然后離心柱以去除多余的水。在第二次旋轉(zhuǎn)色譜柱之前，將樣品添加到樹(shù)脂頂部。在離心過(guò)程中，較大的分子很容易通過(guò)樹(shù)脂并洗脫，而較小的分子會(huì)被困在葡聚糖珠的孔隙中。微珠的尺寸排除能力取決于您選擇的 Sephadex 類(lèi)型。例如，Sephadex G-25 Medium5可用于純化分子量>5000的核酸，G-50 Medium6適用于分子量>30000的分子。
為了加快這一工作流程，請(qǐng)選擇預(yù)裝 Sephadex 的離心柱，而不是自己創(chuàng)建它們，或者在 96 孔過(guò)濾板中工作。
5.2 優(yōu)缺點(diǎn)
就像離心柱純化一樣，該方法可以根據(jù)您的通量需求進(jìn)行調(diào)整，方法是在離心柱或 96 孔濾板中進(jìn)行。不存在分子-基質(zhì)結(jié)合步驟還可以防止對(duì)核酸造成不必要的損傷，7 使其成為一種相當(dāng)溫和的純化方法。然而，這非常耗時(shí)，尤其是在您自己準(zhǔn)備離心柱或過(guò)濾板時(shí)——Sephadex 必須再水合大約三個(gè)小時(shí)——而且不能自動(dòng)化。
5.3 所需設(shè)備
Sephadex 純化所需的唯一設(shè)備是離心機(jī)。
6. 酶促方法
如果您的后續(xù)應(yīng)用，一些制造商會(huì)提供酶法來(lái)清理您的 PCR 產(chǎn)物——例如Sanger 測(cè)序、下一代測(cè)序或 SNP 分析——要求您的樣品不含未摻入的引物和 dNTP。
6.1 它是如何工作的？
酶促方法僅包括兩個(gè)步驟。首先，將酶混合物添加到樣品中，并在 37 °C 下孵育 15 分鐘。在孵育過(guò)程中，混合物中的第一種酶，核酸外切酶 I，將消化多余的引物，第二種酶，堿性磷酸酶，將去磷酸化 PCR 期間未消耗的 dNTP。酶發(fā)揮作用后，您可以將樣品加熱到 80 °C 再加熱 15 分鐘以使酶失活。
6.2 優(yōu)缺點(diǎn)
除了快速簡(jiǎn)便之外，此方法不會(huì)導(dǎo)致樣品損失，并且可以輕松適應(yīng)您的樣品數(shù)量。它唯一的缺點(diǎn)是它只能用于從引物和 dNTPs 中清除 PCR 產(chǎn)物，而不能去除任何其他 cont
7. 結(jié)論
如您所見(jiàn)，每種樣品類(lèi)型、下游應(yīng)用和預(yù)算都有一種核酸純化方法。 我們希望本文能幫助您確定選擇哪一個(gè)來(lái)滿(mǎn)足您的特定需求。
如果您來(lái)這里不僅是為了了解核酸純化的技巧，您可能還想了解收集樣本、提取核酸、執(zhí)行 PCR 反應(yīng)和量化核酸所需的知識(shí)。 當(dāng)我們正在裝備一個(gè)新的內(nèi)部實(shí)驗(yàn)室時(shí)，我們整理了這個(gè)由五部分組成的系列，現(xiàn)在看起來(lái)像這樣：
